Secondo la leggenda, la chiesa fu edificata per volere della regina Matilde di Westfalia (895-9681, la quale, in viaggio verso Roma con una carovana di muli carichi d'oro, per edificare un santuario dedicato al S. Sepolcro, fu costretta a fermarsi ad Acquapendente, nei pressi della porta Romana, poiché i muli si inginocchiarono rifiutandosi di ripartire.
L'indomani la regina ebbe una visione che le suggerì di costruire una chiesa proprio in quel luogo. L'edificio, originariamente a forme romaniche, ha subito nel tempo modifiche sostanziali. Le più importanti durante il XVIII secolo quando, nello stile del barocco settecentesco, vennero interamente modificate la facciata e la navata centrale.
Gli ultimi lavori, che riportarono alla luce i resti della struttura originaria, avvennero dopo la seconda guerra mondiale.
La pianta a croce latina era divisa in tre navate da due file di pilastri. Ai lati della scalinata centrale che conduce al livello superiore dell'altare, si trovano due amboni decorati con bassorilievi XXV secolol.
o spazio sottostante il transetto e l'abside è occupato dalla cripta del S. Sepolcro, caratterizzata da una pianta a"T" e divisa da 24 colonne in nove piccole navate, i cui capitelli, di stile romanico, presentano decorazioni zoomorfe. Probabilmente ]'ambiente è stato realizzato tra il X e il XII secolo. Al centro della cripta, una doppia scalinata scavata nella roccia permette di raggiungere il sacello che riproduce nelle forme il S. Sepolcro di Gerusalemme.
AI suo interno sono custodite alcune pietre incastonate in una lastra di marmo che, secondo la tradizione, sarebbero state bagnate dal sangue di Cristo durante la Passione. All'esterno della basilica, in una grande nicchia della facciata, è situata una copia del busto di Innocenzo X, il cui originale, opera di Alessandro Algardi (1652), è conservato presso il Museo Civico Diocesano della città.
